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⑧ 于37℃保温10min；93℃10min；立即放入冰浴中冷却。
⑨ 另将一份DNase I处理过的RNA样品，加入RNase
A（15μg/份），37℃保温10min，置…20℃保存。
方法B：
① 取5ml新鲜血浆置一支离心管内。
② 40000r/min，4℃离心10min，收集沉淀。
③ 将沉淀物溶于变性液（4。0mmol/L异硫氰酸胍；25mmol/L柠檬酸缓冲液pH7。0；0。5
sarcosyl；0。1mmol/L2…巯基乙醇）中充分混匀。
④ 加入30μl2mmol/L乙酸钠缓冲液pH4。2；400μl酚和80μl氯仿/异戊醇混合液（24：1）；萃取1min；冰上放置20min。
⑤ 13000r/min离心20min。
⑥
轻轻将水相转移到一支新管中。
⑦ 加入3倍体积的无水乙醇；…20℃放置1h左右。
⑧ 13000r/min；4℃离心15min；收集沉淀。
⑨ 沉淀物用75％乙醇洗涤两次；真空干燥。
⑩ 加入10μl 水溶解；立即置…80℃保存或者反转录。
⑾ 取10μl RNA样品。
⑿ 加入10μl 1×PCR缓冲液（50mmol/L NaCl，10mmol/L
Tris … HCl，pH 8。3；1。5mmol/L MgCl2 0。01％明胶）；各0。2mmol/L四种dNTP；10pmol/GN
GHD QLP GX PUH R XHH TR 39；20URNA酶抑制剂（RNsin）；10U的AMV逆转录酶。
⒀ 42℃保温30～60min；然后93℃5min。
⒁ 立即置冰浴中冷却，备用。
由上述方法制得的RNA反转录样品，通过10％聚丙烯酰胺凝胶电泳可鉴定其特异性。
三、PCR扩增步骤
（一）引物的设计与合成
HIV PCR引物设计应遵寻引物设计的一般原则。由于HIV基因易发生变异，因而引物应在保守区内设计，一般在pol、evn、gag、tat基因中的核酸序列内设计，HIV感染的细胞往往很少，要从106个正常细胞中检出1个HIV感染细胞，PCR扩增的引物首先要具有特异的结合HIV相应基因能力，同时一般要采用巢式…PCR方法，来提高检测的灵敏性。
检测HIV引物的第二步骤就是扩增HIV感染细胞中的原病毒DNA。感染细胞与未感细胞混合得到连续的10倍感染细胞的稀释液。通常由103/106个感染细胞稀释至1/106个感染细胞。同时用其它逆转录病毒感染细胞的DNA作对照，进行PCR扩增。然后通过Southern杂交及DNA序列分析，进一步确定扩增产物的特异性。
已经被确定的保守区是gag，tat，evn，pol基因中的某些核苷酸序列。在用于临床标本检测之前，要对引物的特异性进行鉴定。通常取100pg含有HIV基因组序列的质粒DNA稀释液和2μg载体鲱鱼精DNA。如引物是特异的，它们就会指导单一的双股DNA片段的合成。合成的DNA片段相对应于两引物5′末端之间距离。如果是另一种DNA模板，就不会合成任何DNA片段。如果合成的DNA片段不是所预期的或除了有所预期的片段还有其它的DNA片段，那么可以考虑对PCR的条件进行某些改进，看是否能改善其特异性，否则要另选引物。
表6…20 用于HIV PCR扩增的引物及探针
引物
及探针
序列（5′3′）
基
因
区
片段（bp）
SK38
ATAACCACCTATCCCAGTAGGATAAAT
gag
115（HIV1）
SK39
TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC
SK19（P）
ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC
SK145
AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAAT
gag
141（HIV1）
SK101
GCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTC
139（HIV2）
SK102（P）
GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT
SK145
AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAAT
gag
142（HIV1）
SK150
TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTC
139（HIV2）
SK102（P）
GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT
O…1
GGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCAC
gag
525（HIV1）
O…2
TTTTACCTCCTGTGAAGCTTGCTCGGTC
I…2
TTGGTCCTTGTCTTATGTCC
gag
422（HIV1）
I…1
TTAATACGACTCACTATAGGGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGC
GK55
CCTGCTATGTCACTTCCCCT
gag
190（HIV1）
GK56
TTATCAGAAGGAGCCACCCC
P…1
TTCTGTCAATGGCCATTGTTTAACTTTTGGGCCAT
pol
355（HIV1）
P…2
TAAAGGAAGCAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGCTGA
SK29
ACTAGGGAACCCACTGCT
Itr
105（HIV1）
SK30
GGTCTGAGGGATCTCTA
SK31（P）
ACCAGAGTCACACAACAGACGGGCACACACTACT
P13
TGGCGCCCGAACAGGGAC
LTR
168
P14
TACCCACGCTCTCGCAG
SK89
AGGAGCTGGTGGGGAACG
LTR
165（HIV2）
SK90
GTGCTGGTGAGAGTCTAGCA
SK91（P）
TTGAGCCCTGGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCAGGTAG
SK68
AGCAGCAGGAAGCACTATGG
env
142（HIV1）
SK69
CCAGACTGTGAGTTGCAACAG
SK70（P）
ACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGT
CO1
ACAATTATTGTCTGGTATAG
env
135（HIV1）
CO2
AGGTATCTTTCCACAGGCAG
CO3（P）
TGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAG
CO71
TGTGGAGGGAATTCTTCTACTGTAA
env
320（HIV1）
CO72
TATAGAATTCACTTCTCCAATTGTCCCTCAT
CO75（P）
GAAATATTACAGGGCTGCTATTAACAAGAGATGGTGGTAA
（二）PCR扩增步骤
1．扩增条件
当选择的引物影响其特异性和扩增效果时，首先应考虑扩增的条件是否适宜。这些条件包括退火温度，PCR循环数，反应物浓度等。扩增的条件通常是1～4mmol/LMgCl2，0。5～1。0mmol/L
dNTP；每100μl反应体积2～4U Taq DNA聚合酶；2μgBSA；10pg靶DNA；扩增25～30循环；退火温度为37℃；引物浓度6μg/ml。在37～55℃之间变更退火温度可以找到提高产量和特异性的最佳温度。尽管每个实验室使用的扩增条件略有差异；但它们的原理都是相似的。
2。扩增的步骤
（1）取10μl （1。2μg）HIV…DNA样品。
（2）用10μl 1×PCR缓冲液（100mmol/LTris…HCl
pH8。8；500mmol/L KCl，2mmol/L MgCl 2 ；16mmol/L DTT）。
（3）加入10μl ；各1mmol/LdNTP；6。6μg/ml引物。
（4）反应混合物于93℃变性处理7min。
（5）冷却至室温；加入4U TaqDNA聚合酶；反应最终体积为100μl。
（6）加入50μl矿物油；离心10s。
（7）置70℃保温5min。
（8）PCR扩增25个循环；95℃1 min；55℃1min；70℃
1min；最后于70℃延伸10min。
PCR检测出现假阴性的原因有：标本中的HIV…DNA量极少，未能有效地扩增或扩增产物达不到检测水平；DNA模板和PCR产物未能完全变性，使得引物不能或较少与DNA片段结合，从而降低了最终产物的产量。如果临床标本中的HIV基因发生变异，也会出现假阴性。PCR假阳性的原因主要有：标本的交叉污染；重复使用不干净的器具。此外还要合理设置对照，阴性对照用无HIV…DNA标本的反应混合液，阳性对照用已知的HIV…DNA。
四、扩增产物的检测和分析
扩增产物的检测和分析可采用凝胶电泳，限制性内切酶图谱，DNA序列分析及分子杂交等技术。
（一）凝胶电泳分析
根据所采用的引物对之间DNA片段的长度，预计PCR产物的分子大小。通过与凝胶电泳后的DNA片段相比较，可初步判断PCR产物的特异性，然后将产物用限制性内切酶水解，进一步确定扩增产物的特异性。
（二）分子杂交分析
分子杂交既是检测PCR产物特异性的一种较好的方法，也是检测扩增产物的非限制性内切酶位点上碱基突变的有效方法。分子杂交法是根据标记探针与两条引物链之间特异DNA片段的互补性进行的。结果阳性说明PCR产物是特异性的。可利用多种等位基因特异性寡核苷酸探针与PCR产物进行分子杂交，检测PCR产物的碱基突变。现将检测HIV…DNA的PCR扩增产物常用的几种分子杂交技术分别介绍如下：
PCR扩增技术和分子杂交的敏感性。
PCR技术检测HIV具有敏感性高，特异性强的优点。该方法可检测血液及组织标本中微量的HIV及前病毒序列。如对HIV…1感染H9细胞的扩增产物进行液相杂交和EB染色的电泳凝胶来检测PCR技术的灵敏性。可检测到0。05感染细胞的RNA量（相当于5个感染H9细胞的HIV…1…RNA/5×106个未感染细胞）。
四、PCR技术在HIV检测中的应用
PCR可用来追踪HIV的自然感染史。可在其它血清学和病毒学标志出现前检测病毒序列，这样可判定无症状而且血清阴性患者潜在的HIV的传播性；可用来监测长潜伏期（4～7年）病人，以及在抗病毒治疗期间病毒的水平；也可用于HIV…1血清阳性母亲的婴儿的HIV检测。在婴儿出生后最初的6～9个月期间，他们的血液中存在母体的抗体，因此用PCR可判定婴儿是否真正被HIV感染。
（一）血清抗体阳性病人HIV序列的检测
有人从AIDS或ARC病人的外周血单核细胞培养物，精液细胞和精液上清制备DNA。然后用PCR法和逆转录酶测定法分别检测HIV…1。PCR扩增产物与32P标记的探针退火之后用BstNI消化。再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和自显影。结果表明，在逆转录酶阴性的28个细胞系中有9个以及用逆转录酶法不能确定的9个细胞系中有2个为阳性。这说明过去许多细胞培养物认为是阴性者，实际上用更敏感的PCR测定时则为阳性。
从血清阳性的HIV感染者的外周血单核细胞中可检测出前病毒序列。通过共培养分离出病毒的血清阳性的同性恋男人血液制备的DNA，用PCR可100％检出病毒序列；用血清阴性共培养阴性同性恋者的标本，经PCR扩增检出病毒序列者为64％，血清阴性正常人标本PCR检测也为阴性，表明未出现假阳性结果。由于HIV…1基因组的广泛的异源性，为提高检测的阳性率可采用多种引物（如LTR，gag和env基因的引物）。利用PCR法从313份已证实为抗体阳性的标本中检测出310份HIV阳性（99％）。
（二）血清抗体阴性病人的HIV序列的检测
由于在感染HIV后到出现免疫反应之前有一段滞后期；这个血清学阴性的滞后期通常长达6周至6个月；而且无抗体产生期可能更长些。�